蛋白質(zhì)及其復(fù)合物、組裝體完整三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定,是研究生命活動(dòng)中分子結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系,并揭示生命現(xiàn)象物理化學(xué)本質(zhì)的科學(xué)基礎(chǔ)。目前,生命科學(xué)的主要目的是揭示基因組的功能,并在此基礎(chǔ)上闡明遺傳、發(fā)育、進(jìn)化、功能調(diào)控等基本生物學(xué)問題,以及進(jìn)一步解決與醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)密切相關(guān)的問題。由于基因的功能最終將通過其表達(dá)產(chǎn)物即蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn),因此,要了解基因組全部功能活動(dòng)(包括正常的和異常的),最終也必須回到蛋白質(zhì)分子上來。蛋白質(zhì)的主要功能則取決于其三維結(jié)構(gòu),目前,X射線晶體法是最常用的解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的手段,該方法成功與否取決于是否可以得到高質(zhì)量的蛋白質(zhì)單晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶過程是蛋白質(zhì)分子從無序變?yōu)橛行?從而從溶液中析出成為晶體的過程。由于蛋白質(zhì)分子之間相互作用千差萬別、蛋白質(zhì)晶體產(chǎn)生條件荀刻,導(dǎo)致大量與人類、植物等相關(guān)的重要蛋白質(zhì)難以結(jié)晶,從而無法得知其結(jié)構(gòu)并對(duì)其功能進(jìn)行研究為了得到高質(zhì)量的晶體,研究者致力于開發(fā)異質(zhì)成核劑以促進(jìn)蛋白質(zhì)產(chǎn)生晶體并且已經(jīng)取得一定的成果,但是由于這些成核劑對(duì)蛋白質(zhì)缺乏特異性親和能力,導(dǎo)致結(jié)晶實(shí)驗(yàn)成功率低,且隨機(jī)性大。因此,開發(fā)一種與蛋白質(zhì)具有高度親和性、普適的成核劑材料非常關(guān)鍵。

　　蛋白質(zhì)磷酸化修飾是非常重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾,迄今發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質(zhì)中超過50%均可被磷酸化修飾。蛋白質(zhì)磷酸化作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,幾乎與機(jī)體的所有生命活動(dòng)有關(guān),在控制細(xì)胞生存進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用,這些進(jìn)程包括:細(xì)胞循環(huán)、生長(zhǎng)、分化和凋亡等在植物體中,蛋白質(zhì)的可逆磷酸化與植物抵抗外界環(huán)境脅迫有關(guān),如抵抗病原菌侵害、抗寒、抗旱、抗鹽等。目前,對(duì)于植物的研究主要局限在模型植物擬南芥等特定激酵的憐酸化進(jìn)程上作為自然界廣泛存在的生物,植物與人類的關(guān)系密不可分,磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究非常必要。然而蛋白質(zhì)磷酸化是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)變化的過程,而且具有低化學(xué)計(jì)量、低豐度的特點(diǎn),這些特點(diǎn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)磷酸化分析非常具有挑戰(zhàn)性。此外,由于植物細(xì)胞中含有大量的細(xì)胞壁等組織,以及植物葉片中大量存在的核酮糖等干擾物質(zhì),導(dǎo)致植物憐酸化蛋白質(zhì)極難分離,從而給植物磷酸化蛋白質(zhì)的研究造成很大障礙,因此,發(fā)展一種高效地植物憐酸化蛋白質(zhì)分離手段非常重要已經(jīng)建立起來的磷酸化蛋白質(zhì)/多肽富集方法主要分為三類,即免疫沉淀法、化學(xué)衍生法和親和色譜法,在這三類方法中,免疫沉淀法是用來富集磷酸化蛋白質(zhì),而另外兩種方法均是用來富集憐酸化多肽。免疫沉淀法是利用磷酸化蛋白質(zhì)上的磷酸化殘基與抗體之間的特異性結(jié)合,從而將憐酸化蛋白質(zhì)從樣品中分離出來的一種方法,利用這種方法,一些酪氨酸位點(diǎn)磷酸化的蛋白質(zhì)被鑒定出來,例如等刺激因子。這種方法的最大缺點(diǎn)是,對(duì)于發(fā)生絲氨酸和蘇氨酸_酸化的蛋白質(zhì),因?yàn)榈貌坏较鄳?yīng)的抗體,幾乎沒有辦法富集,雖然現(xiàn)在也有一些通過該方法富集得到絲氨酸鱗酸化的蛋白質(zhì)。

1.固定金屬離子親和色譜材料

　　1975年,首次在蛋白質(zhì)分離中引入固定金屬離子親和色譜法(IMAC),并在隨后的研究中大力推進(jìn)該方法的發(fā)展。在隨后的十年里,關(guān)于在蛋白質(zhì)或者多肽分離中應(yīng)用IMAC技術(shù)的文章數(shù)量飛速發(fā)展,目前,IMAC在磷酸化多肽領(lǐng)域的研究主要集中在兩個(gè)方面,一是IMAC材料的制備,二是吸附和解及附緩沖液的優(yōu)化。在IMAC材料的制備部分主要有三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),即基質(zhì)、整合基團(tuán)、金屬離子,對(duì)于現(xiàn)有MAC材料各部分的選擇,亞氨基二乙酸和次氮基三乙酸的應(yīng)用相對(duì)較廣,與之相對(duì)應(yīng)的金屬離子為Fe3+和Ga3+,對(duì)于基質(zhì)來說,瓊脂糖、纖維素、二氧化桂的應(yīng)用較為廣泛,而且已經(jīng)有商品化的產(chǎn)品,但是大量實(shí)驗(yàn)表明,以這些材料為基礎(chǔ)的IMAC在鱗酸化多肽的富集過程中,缺乏足夠的專一性,在富集磷酸化多肽的同時(shí)會(huì)吸附大量的酸性非磷酸化多肽(主要是含有大量梭基的多肽),為了避免這種非特異性吸附現(xiàn)象的發(fā)生,美國(guó)Viginia大學(xué)的White小組在采用IMAC對(duì)磷酸化多肽進(jìn)行富集前,首先對(duì)樣品進(jìn)行羧基的化反應(yīng),從而降低酸性非磷酸化多肽的吸附,但是由此帶來的副反應(yīng)以及反應(yīng)不完全均會(huì)對(duì)樣品造成污染,進(jìn)而使得后續(xù)質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度降低。除了將MAC制備成常規(guī)的小球外,復(fù)旦大學(xué)的原教授研究小組、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的錢小紅研究小組等將MAC做成帶有磁性的載體,基本原理是利ffiFe304@C材料,在其外殼改性并且固定金屬離子,從而得到具有磁性的IMAC,因?yàn)椴牧暇哂写判?所以在分離時(shí)非常方便。

　　MAC材料制備之后,需要對(duì)其富集過程中釆用的緩沖液體系進(jìn)行優(yōu)化,從而降低酸性非磷酸化多肽的非特異性吸附。已經(jīng)有研究表明緩沖液的組成、pH值的細(xì)微改變均會(huì)對(duì)最終的富集效果產(chǎn)生影響不僅在材料方面做了深入的研究,在緩沖液的選擇上也做了大量研究,在其對(duì)洗脫緩沖液體系進(jìn)行優(yōu)化時(shí),發(fā)現(xiàn)磷酸和乙腈的混合液可以取得非常好的洗脫效果。IMAC法不論是在材料還是在緩沖液的選擇性,近年來都取得了很大進(jìn)展。

2.分子印跡材料

　　印跡材料的概念于1931年被Polyakov首次提出,但是直到20世紀(jì)80年代,關(guān)于分子印跡技術(shù)的研究依然處于空白期。分子印跡屬于超分子化學(xué)研究范疇,是指以某一特定的目標(biāo)分子為模板,制備對(duì)該分子具有特異選擇性材料的過程,該技術(shù)被描述為可以識(shí)別“分子鋼匙”的“人工鎖”技術(shù)。分子印跡技術(shù)一般分為三個(gè)步驟:1)模板分子與功能單體在溶劑中通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物;2)加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑,在紫外光或熱引發(fā)下發(fā)生聚合作用,使得模板分子周圍形成高度交聯(lián)的剛性聚合物;3)通過水解或萃取的方法將模板分子洗脫,從而在聚合物中留下了與模板分子的大小、形狀及功能基團(tuán)相匹配的空穴。目前,全世界至少有包括瑞典、日本、德國(guó)、美國(guó)、中國(guó)等在內(nèi)的幾十個(gè)國(guó)家、上百個(gè)學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)和企事業(yè)團(tuán)體在從事分子印跡材料的研究和開發(fā)。在過去的20年里,有關(guān)分子印跡技術(shù)的研究飛速發(fā)展,分子印跡技術(shù)的潛力被逐步挖掘出來,應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣泛。分子印跡技術(shù)發(fā)展如此迅速,主要因?yàn)樗腥筇攸c(diǎn):構(gòu)效預(yù)定性、特異識(shí)別性和廣泛適用性。基于該技術(shù)制備的分子印跡材料具有親和性和選擇性高、抗惡劣環(huán)境能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、使用壽命長(zhǎng)、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn),歐盟委員會(huì)早在1998年已經(jīng)啟動(dòng)了一項(xiàng)專門自主歐洲8個(gè)研究小組從事印跡材料的制備、結(jié)構(gòu)表征,以及分子印跡材料用于臨床分析、環(huán)境分析以及生物分析等方面的研究。

　　目前,分子印跡技術(shù)在小分子領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)非常成熟,然而,對(duì)于復(fù)雜的生物大分子的研究依然匱乏,雖然已經(jīng)有研究報(bào)道將分子印跡技術(shù)應(yīng)用到蛋白質(zhì)、DNA、甚至病毒的研究上，但是在蛋白質(zhì)、微生物細(xì)胞等生物大分子的應(yīng)用上依然處于起步階段。按照合成方法進(jìn)行分類,分子印跡聚合物可以分為以下幾類:本體聚合、懸浮聚合、沉淀聚合、表面分子印跡以及抗原印跡技術(shù)等。本體聚合是最為常見的一種分子印跡聚合物合成方法,合成時(shí),將功能單體及模板分子溶解在同一種溶液中,交聯(lián)后對(duì)材料進(jìn)行干燥、研磨、蹄分、模板分+洗脫,從而得到粒徑處于一定范圍的分+印跡聚合物。已經(jīng)被應(yīng)用在毛細(xì)管屯泳、高效液相色譜以及薄層色譜中。但是由于通過該方法合成的分子印跡聚合物需要進(jìn)行研磨,將導(dǎo)致產(chǎn)物顆粒不均一、人量高親和鍵合位點(diǎn)被破壞以及模板分-f洗脫不徹底的問題,因此大大限制了該方法的應(yīng)fH。為了更好地應(yīng)用分子印跡技術(shù),許多其它的合成方法被建立。懸浮聚合是將模板分子、功能單體以及交聯(lián)劑溶解丁?有機(jī)溶劑中,然后移入水溶液中進(jìn)行攪拌、乳化,之后引入引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)的發(fā)生,最后通過干燥、模板分子洗脫,可以得到粒徑相對(duì)均的多分散分子印跡聚合物。

　　表面分子印跡是指在分子印跡聚合物制備的過程中,將結(jié)合位點(diǎn)限在表面,模板分子的洗脫和再結(jié)合均發(fā)生在表面,因此非常適合對(duì)丁?生物大分子的印跡。通常,表面印跡是在微球載體表面進(jìn)行修飾或涂層制備得到,制備過程中,功能單體與印跡分子在乳液界面處結(jié)合,交聯(lián)劑與單體聚合后,這種結(jié)合物結(jié)構(gòu)就印在了聚合物的表面。抗原印跡技術(shù)是表面分子印跡技術(shù)的一種,是根據(jù)自然界中抗原與抗體之間特異性的相互作用而建立的一種方法,采用目標(biāo)蛋白質(zhì)分子暴露在表面的特征肽段(抗原決定基)作為模板分子,制備得到不僅可以識(shí)別模板分子,同時(shí)也可以識(shí)別以模板分子為特征部位的蛋白質(zhì)分。該技術(shù)的引入為制備新型蛋白質(zhì)分子印跡材料提供了新思路。

3.固定鈦離子親和色譜材料的制備及應(yīng)用

　　蛋白質(zhì)翻譯后修飾在蛋白質(zhì)加工、成熟的過程中發(fā)揮著重要作用,它可以改變蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì),影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、立體位阻及穩(wěn)定性。可逆蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最為廣泛的一種,其在細(xì)胞代謝、增殖、分化、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等生理過程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在植物體內(nèi),可逆蛋白質(zhì)憐酸化與植物抵抗外界環(huán)境脅迫有著密切關(guān)系,這些脅迫主要有生物或者非生物脅迫,如鹽脅迫、激素脅迫、溫度脅迫等等。對(duì)植物來說,鹽脅迫是最為廣泛的一種脅迫方式,有研究報(bào)道,在未來10年,鹽脅迫將影響50%的植物。為了抵抗外界環(huán)境的威脅,植物體已經(jīng)進(jìn)化出一套高度精細(xì)的信號(hào)感知、傳導(dǎo)以及細(xì)胞反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中,可逆蛋白質(zhì)磷酸化進(jìn)程起到的關(guān)鍵的作用。在我國(guó),玉米是一種主要的糧食作物,關(guān)于其抵抗外界鹽脅迫條件下的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,將有助于人們認(rèn)清植物抵抗鹽脅迫的機(jī)理,并為開發(fā)抗鹽脅迫的品種提供理論依據(jù)。目前,在植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得一些進(jìn)展,但是這些研究對(duì)象主要集中擬南芥、水稻等模式植物,鮮有關(guān)于玉米磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報(bào)道。已有的關(guān)于玉米憐酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,研究重點(diǎn)也僅局限在在玉米根系中特定蛋白質(zhì)的研究上此外,這些研究主要釆用雙向電泳的手段研究憐酸化蛋白質(zhì),研究者需要投入大量的時(shí)間、精力、金錢完成研究工作。隨著質(zhì)譜技術(shù),以及以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的隣酸化蛋白質(zhì)富集方法的發(fā)展,例如金屬氧化物親和色譜法(MOAC)、固定金屬離子親和色譜法(MAC),高通量的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法被應(yīng)用在人體、動(dòng)物疾病磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中。

　　在眾多以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的憐酸化蛋白質(zhì)富集方法中,MAC是一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)的方法。2011年,Bi等采用金屬氧化物親和色譜法從正常的玉米葉中分離得到125種磷酸化蛋白質(zhì)。然而,并沒有研究人員采用MOAC或者IMAC對(duì)鹽脅迫條件下的玉米憐酸化蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究。有研究表明,MOAC和MAC富集得到的憐酸化蛋白質(zhì)/多肽的種類差異性很大,為了更加全面地了解鹽脅迫條件下玉米體內(nèi)磷酸化進(jìn)程,需要在玉米磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中采用MAC的方法,這是因?yàn)樵蕉鄳z酸化蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn),將會(huì)幫助研究者更好地理解玉米抵抗鹽脅迫的生理機(jī)制。

　　有研究表明,上樣緩沖液的組成對(duì)IMAC的富集效果有著重耍的影響。上樣緩沖液的組成、pH值等的微小改變都會(huì)造成結(jié)果的巨大差異。為了提高材料的特異性,上樣緩沖液的組成以及IMAC材料基質(zhì)的選擇成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究表明,一旦非磷酸多肽鍵合到IMAC材料上,將很難被去除。因此,從源頭,即上樣過程抑制非憐酸化多肽的鍵合非常關(guān)鍵。到目前為止,幾乎所有采用IMAC富集磷酸化多肽的研究中,都采用不同比例的乙腈和三氟,乙酸混合溶液作為上樣緩沖溶液。這是因?yàn)橹T如三氟乙酸等的強(qiáng)酸可以使含有羧基的酸性多肽發(fā)生質(zhì)子化,從而阻止這種酸性的磷酸化多肽鍵合到MAC材料上。在實(shí)驗(yàn)室合成了一種固定鈦離子親和色譜材料,并對(duì)該材料所需的上樣緩沖溶液進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)80%乙腈、6%三氟乙酸的緩沖溶液效果最佳。如此高比例的乙腈被應(yīng)用是由于其可以降低MAC材料和非磷酸化多肽之間的疏水相互作用。同時(shí),一些研究也表明在磷酸和乙腈的混合溶液中,改變其中乙腈的含量,磷酸溶液的pH值始終保持穩(wěn)定。研究表明采用不含乙腈的6%乙酸溶液(pH 3.5), IMAC材料富集磷酸化多肽的效果最。也有一些研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)上樣緩沖液中含有高濃度的有機(jī)酸,如2,5-二輕基苯甲酸或鄰苯二甲fe,可以極大地抑制結(jié)果中非憐酸化多肽的數(shù)量(Thingholm,2006; Larsen,2005)。這些研究表明當(dāng)上樣緩沖液由高濃度的有機(jī)酸如鄰苯二甲酸氫鉀等組成時(shí),固定金屬離子親和色譜或許將發(fā)揮最佳的效果。在前人的研究中,磷酸化修飾的殼聚糖和纖維素被用來作為合成MAC材料的基質(zhì)材料,然后鐵離子被固定作為螯合憐酸化多肽的官能基團(tuán)。然而,由于殼聚糖和纖維素不能溶解于水溶液中,因此如果在水相中對(duì)其進(jìn)行磷酸化改性時(shí),改性只能發(fā)生在表面,反應(yīng)為非均相的反應(yīng)。眾所周知,聚乙烯醇是一種高水溶性的生物相容性高分.1^物質(zhì),而且具有抗非特異性吸附的特點(diǎn),因此很適合作為憐酸化多肽的富集材鑒于其的水溶性,其與憐酸的均相反應(yīng)可以在水溶液中進(jìn)行。另外,由于聚乙烯醇和磷酸反應(yīng)可以生成凝膠狀的物質(zhì),因此產(chǎn)物擁有較大的比表面積,也就為后續(xù)鈦離子的固定提供了更多的位點(diǎn)。

4.固定沉淀劑分子印跡聚合物的應(yīng)用

　　蛋白質(zhì)及其復(fù)合物、組裝體完整三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定是研究生命活動(dòng)中分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系,揭示生命現(xiàn)象的物理化學(xué)本質(zhì)的科學(xué)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)及其復(fù)合物晶體的X-射線衍射是研究生物大分子三維精細(xì)結(jié)構(gòu)的最主要的手段之一。在人類基因組全序列測(cè)定順利完成和“后基因組時(shí)代”到來之際,生命科學(xué)的中心任務(wù)是揭示基因組的功能,并在此基礎(chǔ)上闡明遺傳、發(fā)育、進(jìn)化、功能調(diào)控等基本生物學(xué)問題,以及進(jìn)一步解決與醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)密切相關(guān)的問題。由于基因的功能最終總是通過其表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的,因此,要了解基因組全部功能活動(dòng)(包括正常的和異常的),最終也必須回到蛋白質(zhì)分子上來。

　　蛋白質(zhì)是很多治療疾病藥物的作用目標(biāo),而蛋白質(zhì)的主要功能則取決于其三維結(jié)構(gòu)。目前,X-射線衍射法是最常用的解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的手段,該方法成功與否取決于是否可以得到高質(zhì)量的蛋白質(zhì)單晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶過程是蛋白質(zhì)分子從無序變?yōu)橛行?從而從溶液中析出成為晶體的過程。為了得到高質(zhì)量的晶體,主要的手段是控制蛋白質(zhì)結(jié)晶的成核階段,即蛋白質(zhì)結(jié)晶過程的第一步。有研究表明,可以通過在亞穩(wěn)定狀態(tài)下引入異質(zhì)成核劑達(dá)到誘導(dǎo)晶體產(chǎn)生的目的。目前,常用的異質(zhì)成核劑主要有礦物質(zhì)、人類毛發(fā)、娃等多孔材料、生物玻璃、沸石、聚合物材料。雖然,這些成核劑在一定程度上提高了晶體生長(zhǎng)的幾率,但是由于其對(duì)蛋白質(zhì)缺乏特異性親和能力,因此,這些成核劑的成功率低,且隨機(jī)性大。通過前面的幾章的介紹,了解到分子印跡聚合物(MIPS)由于在其合成過_中以待測(cè)目標(biāo)分子或類似物作為模板,之后將該模板洗脫,從而在聚合物表面留有與模板分子完全吻合的空穴因此MIPS對(duì)目標(biāo)分子具有高度地特異性親和能力,這種特質(zhì)可能將有助于促進(jìn)難以結(jié)晶的蛋白質(zhì)產(chǎn)生晶體，在2011年,在蛋白質(zhì)結(jié)晶中引入了 MIPs,由于 MIPs 的介入三種蛋白質(zhì)結(jié)晶的成功率提高了 8-10%。在2012年,Reddy等對(duì)比了三種兩稀酰胺類的MIPs在蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn),發(fā)現(xiàn)含有N-輕甲基丙烯酰胺的MIPs在蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中效果最佳。

　　眾所周知,晶體生長(zhǎng)的首要條件即是過飽和狀態(tài),在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶研究中,沉淀劑被用來幫助蛋白質(zhì)達(dá)到過飽和狀態(tài),沉淀劑可以通過改變蛋白質(zhì)-溶劑或者蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用,從而有助于蛋白質(zhì)分子更快的達(dá)到過飽和狀態(tài)。然而,許多重要的蛋白質(zhì)含有多變的結(jié)構(gòu)域以及連接體,這種多變的結(jié)構(gòu)使得溶液中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象千差萬別,因此,這些蛋白質(zhì)很難通過常規(guī)的結(jié)晶手段得到其高質(zhì)量的單晶,從而難以充分認(rèn)識(shí)其結(jié)構(gòu),并了解其作用。為了更好地促進(jìn)結(jié)構(gòu)靈活多變的重要蛋白質(zhì)的結(jié)晶,在這部分的研究中,開發(fā)了另一種新型的分子印跡聚合物來幫助蛋白質(zhì)晶體產(chǎn)生,在該聚合物中首次最常用的兩種沉淀劑,即將硫酸銨和聚乙二醇固定在了分子印跡聚合物中,此種新型的聚合物被命名為piMIPs,即固定沉淀劑分子印跡聚合物,并且按照其上固定沉淀劑種類的不同將其進(jìn)一步命名為piMIPi(沉淀劑為聚乙二醇)

5.分子印跡薄膜的制備及應(yīng)用

　　CHt是一種長(zhǎng)壽命的溫室效應(yīng)氣體,其在大氣中的濃度雖然極低,但對(duì)溫室效應(yīng)的相對(duì)貢獻(xiàn)率卻達(dá)到15%,而且每年有遞增0.8%-1.0%的趨勢(shì)。就全球尺度而言,關(guān)于CRt的源主要是天然濕地、稻田、反當(dāng)動(dòng)物、化石燃料生產(chǎn)過程、垃圾處理及淺水湖沼。目前分離出的甲焼氧化菌幾乎都是專性氧化甲焼的,不能利用其他基質(zhì)。在甲焼氧化菌的作用下,甲燒經(jīng)過一系列中間體甲醇、甲K、甲酸被氧化成二氧化碳,而甲燒氧化菌則從這些氧化途徑獲得能量,并利用中間產(chǎn)物甲醛作為唯一或主要的碳源供自身生長(zhǎng)用。雖然土壤CH4氧化僅占全球CH4總匯的10%,但是,CHU氧化微生物在好氧-厭氧交界面處起到了限制土壤CH4向大氣排放的作用,因此也是大氣CRt的顯著的匯。—些研究者通過比較好氧和嚴(yán)格厭氧條件下CH4排放量之間的差異,發(fā)現(xiàn)水稻田產(chǎn)生的CH4,平均有80%在排放到大氣中之前己被土壤中的甲燒氧化菌所氧化。據(jù)估計(jì),土壤中的好氧甲焼氧化菌每年消耗掉30 Tg的CH4,因此，微生物消耗作用不僅限制了許多CH4源的排放量,而且也是大氣CH4的非常重要的匯。前對(duì)甲院氧化菌的研究主耍有兩種不同的途徑:第一個(gè)途徑是使傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)將甲院氧化菌分離后進(jìn)行純培養(yǎng),然后對(duì)甲燒氧化歯進(jìn)行生理生化遺傳學(xué)特征研究,針對(duì)甲焼氧化歯的獨(dú)立性狀進(jìn)行菌體闡述,從而發(fā)現(xiàn)有特殊應(yīng)W價(jià)值的甲焼氧化菌;第二種途徑不需富集培養(yǎng)甲燒氧化歯,主要是對(duì)甲綜氧化菌進(jìn)行生態(tài)學(xué)研究,依靠PCR技術(shù)及甲綜氧化菌特異的進(jìn)化和功能基因的DNA/RNA序列數(shù)據(jù)摔和PCR (多聚核U酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù))技術(shù)在一起,使許多分子生態(tài)學(xué)手段可以直接應(yīng)用于甲焼氧化菌的研究中,如PCR、16S rRNA、DGGE (變性梯度凝膠電泳技術(shù))、PLFA (磷脂酸分析)、FISH (原位熒光染交法)等。通常認(rèn)為通過富集培養(yǎng)方法,從純培養(yǎng)基中獲得到的甲焼氧化菌只是環(huán)境中甲燒氧化歯的一部分,并不能分離得到所有的甲焼氧化菌。